包括外泌體在內(nèi)的細(xì)胞外囊泡可由包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的所有細(xì)胞釋放。它能夠?qū)⒅|(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸遞送到附近和遠(yuǎn)端細(xì)胞，已有研究表明外泌體在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)展中起作用。迄今為止，大多數(shù)關(guān)于這些囊泡在健康和疾病狀態(tài)中的作用的分析都依賴(lài)于研究來(lái)自體外來(lái)源的囊泡，例如條件細(xì)胞培養(yǎng)基或體液。
墨爾本大學(xué)的研究人員采用了一種關(guān)鍵的方法來(lái)富集和表征來(lái)自人類(lèi)額葉皮層的外泌體。該方法保持了囊泡及其貨物的完整性，并且全面的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組表征證實(shí)了所得細(xì)胞外囊泡作為內(nèi)體衍生的外泌體的可靠性。這種方法將使神經(jīng)科學(xué)家能夠獲得關(guān)于大腦外泌體的更詳細(xì)的信息，并探索這種細(xì)胞間通訊形式的作用，以及脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA的獨(dú)特來(lái)源在健康的大腦功能和疾病狀態(tài)下的作用。此外，該方法對(duì)于從其他組織中分離外泌體可能具有重要的借鑒意義。
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，分兩步：
第一步、通過(guò)消化組織得到含有細(xì)胞外囊泡的上清液；
第二步、通過(guò)三重蔗糖墊超速離心法分離外泌體。
詳細(xì)方案如下，
將新鮮冷凍（-80°C）人額葉皮質(zhì)在冰上用剃刀刀片切片，產(chǎn)生1-2cm長(zhǎng)、2-3mm寬的切片。冷凍切下的切片組織用75 U/mL 3型膠原酶在Hibernate-E中、37°C條件下消化20分鐘。消化后立即將組織放回冰中，加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑。將組織在4℃下以300×g離心5分鐘（沉淀用作腦勻漿+膠原酶對(duì)照），將上清液轉(zhuǎn)移至新管中，在4℃下以2000×g離心10分鐘，然后在4℃以10,000×g離心30分鐘。將含有EV的上清液覆蓋在三重蔗糖墊（0.6M，1.3M，2.5M）上并以180,000×g超速離心3小時(shí)分離囊泡。棄去梯度的頂部，收集指定為1,2和3的級(jí)分并測(cè)量折射率。將每個(gè)級(jí)分進(jìn)一步以100,000×g超速離心以沉淀每個(gè)級(jí)分中所含的囊泡。每個(gè)樣本均通過(guò)包括電子顯微鏡、RNA和蛋白質(zhì)分析在內(nèi)的技術(shù)組合進(jìn)行驗(yàn)證。注意：一些組織樣本不適合這種方法。取樣時(shí)間、儲(chǔ)存時(shí)間和凍融循環(huán)次數(shù)會(huì)對(duì)組織質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響，并導(dǎo)致細(xì)胞碎片和非外泌體囊泡對(duì)組分產(chǎn)生污染。
參考文獻(xiàn)：
Vella LJ, Scicluna BJ, Cheng L, Bawden EG, Masters CL, Ang CS, Willamson N, McLean C, Barnham KJ5, Hill AF. (2018) A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles 6(1):1348885.
